La diagnosi di sindrome APA si basa su esami clinici e di laboratorio e richiede almeno un criterio clinico insieme a un criterio di laboratorio (Tabella I).
Secondo le linee guida del Comitato Scientifico e di Standardizzazione (SSC) dell’ISTH, il test dell’anticoagulante lupico deve essere eseguito solo nei pazienti a rischio significativo di sindrome APA o che presentano un prolungamento inspiegabile del tempo di cefalina attivata (aPTT).
La diagnosi di laboratorio è complessa a causa della mancanza di cambiamenti nei parametri di laboratorio patognomonici per la sindrome APA.
La diagnosi di laboratorio si basa quindi su una batteria di test che comprende test di coagulazione ed ELISA.
Test di coagulazione
I test di coagulazione vengono eseguiti per dimostrare la presenza dell’anticoagulante lupico in grado di prolungare il tempo dei test di coagulazione a base di fosfolipidi.
La presenza di anticoagulante lupico è altamente specifica per la sindrome APA e vi è una forte associazione tra quest’ultima e gli eventi trombotici o la perdita del feto.
Tuttavia, il numero di false positività e false negatività è piuttosto elevato.
Molti fattori possono influenzare la mancanza di sensibilità e specificità di questi test, tra cui le variabili pre-analitiche, analitiche e post-analitiche.
Criteri diagnostici per anticoagulante lupico circolante
Esistono quattro criteri di questo tipo, riassunti di seguito.
| 1. Prolungamento dei tempi dei test di coagulazione dipendenti dai fosfolipidi |
| 2. Dimostrazione dell’inibizione in un test di miscela plasma del paziente/normale |
| 3. Dimostrazione che il tempo di coagulazione prolungato è dipendente dai fosfolipidi: accorciamento o correzione del tempo di coagulazione inizialmente prolungato con l’aggiunta di un eccesso di fosfolipide (test di conferma) |
| 4. Esclusione di inibitori specifici diretti contro i fattori della coagulazione (ad es. anticorpi anti-fattore VIII) |
Variabili preanalitiche nello screening dell’anticoagulante lupico circolante
La fase preanalitica è fondamentale per la diagnosi di sindrome APA.La presenza di piastrine residue nel plasma può influenzare i test di coagulazione che dipendono dai fosfolipidi derivati dalle piastrine; tali fosfolipidi possono neutralizzare gli anticorpi antifosfolipidi presenti nel campione e produrre falsi negativi. Si raccomanda pertanto di eseguire una doppia centrifugazione, comprendente una prima centrifugazione a 2.000 g per 15 minuti a temperatura ambiente, seguita da una seconda centrifugazione a oltre 2.500 g per 10 minuti, al fine di ottenere un plasma contenente meno di 10.000 piastrine/µl.
Scelta dei test
Sono stati proposti molti test dipendenti dai fosfolipidi.
A causa della diversa sensibilità dei vari test e della mancanza di standardizzazione di alcuni di essi, la Società Internazionale per la Trombosi e l’Emostasi (ISTH) ha emanato delle linee guida sulla scelta dei test da utilizzare.
È necessario utilizzare due sistemi di test separati che adottino principi diversi.
Il tempo di veleno di vipera Russell diluito (DRVVT) deve essere utilizzato in tutti i casi. Questo test è considerato specifico e robusto per la rilevazione dell’anticoagulante lupico.
Il secondo test da eseguire è l’aPTT che utilizza la silice come attivatore a causa della sua sensibilità. L’uso del caolino o dell’acido ellagico come attivatore, il tempo di tromboplastina diluita, i test basati sui tempi di ecarina o textarina e il tempo di coagulazione al caolino non sono raccomandati.
Test di miscela
Il plasma in pool utilizzato deve essere preparato secondo i metodi abituali. È necessaria una doppia centrifugazione per ottenere un plasma contenente meno di 10.000 piastrine/µl e con un’attività vicina al 100% per tutti i fattori. È possibile utilizzare il plasma commerciale in pool, liofilizzato o congelato, a condizione che soddisfi le condizioni richieste e sia stato convalidato per questo scopo.
Il test di miscela deve prevedere un rapporto di 1:1 tra il plasma del test e il plasma normale in pool senza preincubazione.
Il test del tempo di trombina prima dello studio di miscela potrebbe dimostrare la presenza nel campione di eparina o di altri inibitori. Tuttavia, alcuni reagenti, in particolare quelli utilizzati nei test DRVVT, contengono un inibitore dell’eparina, che consente di eseguire il test in campioni contenenti fino a 0,8 UI di anti-Xa/ml.
Test di conferma
Si tratta di valutare la correzione del tempo di coagulazione per il campione di plasma in presenza di un eccesso di fosfolipidi. È opportuno utilizzare fosfolipidi a doppio strato (bilayer) o fosfolipidi a fase esagonale. Al contrario, l’uso di piastrine scongelate è sconsigliato a causa della variazione tra i lotti.
Esclusione di inibitori specifici diretti contro i fattori della coagulazione
Lo screening di un inibitore specifico diretto contro un determinato fattore della coagulazione (principalmente il fattore VIII o il fattore IX) è essenziale, poiché la presenza di tali inibitori può esporre i pazienti a un rischio emorragico elevato e potenzialmente letale, che richiede una gestione immediata da parte di team specializzati. Questo test prevede il dosaggio del fattore in questione e, se necessario, lo screening specifico e il dosaggio dell’inibitore.
Test ELISA
Lo screening degli anticorpi anti-cardiolipina e anti-ß2-GPI è indicato nella classificazione della sindrome APA (Tabella I). Sebbene lo screening per gli anticorpi IgG e IgM sia necessario in entrambi i casi, il valore dello screening per gli anticorpi IgM è controverso a causa della loro apparentemente scarsa correlazione con i segni trombotici. Inoltre, nell’interpretare i risultati dei test per gli anticorpi IgM, occorre tenere conto della possibile presenza di crioglobulina o fattore reumatoide.
Lo screening degli anticorpi anti-ß2-GPI è particolarmente importante nei pazienti con risultati negativi allo screening dell’anticoagulante lupico nonostante il forte sospetto di sindrome APA. Il test degli anticorpi anti-ß2-GPI sembra più specifico di quello degli anticorpi anticardiolipina nella diagnosi di sindrome APA. Lo screening degli anticorpi anti-ß2-GPI può infatti essere l’unico test positivo per il 3-10% dei pazienti che presentano sindrome APA. Nonostante la mancanza di standardizzazione del test, l’analisi degli anticorpi anti-ß2-GPI sembra più riproducibile di quella degli anticorpi anticardiolipina.
Altri test
Generazione di trombina e anticorpi antifosfolipidi
Studi hanno dimostrato l’inibizione della generazione di trombina nei pazienti con sindrome APA, in particolare in presenza di anticorpi anti-ß2-GPI. Inoltre, l’inibizione della generazione di trombina è correlata all’esistenza di segni clinici precedenti.